1-  هدف:

تفكیك باسیل های روده ای گرم منفی ( بر اساس تخمیر كربوهیدرات و تولید سولفید هیدروژن )

 

2-  اساس آزمایش:

در این محیط كشت، ساكاروز به دو قندی (دكستروز و لاكتوز) که در محیط كلایگلر آیرون آگار (KIA) وجود دارد، اضافه می شود. افزودن ساكاروز، با تسهیل در جداسازی باسیل های تخمیر كننده ساكاروز و نیز تخمیر كننده های لاكتوز و یا دكستروز، حساسیت محیط را افزایش می دهد. تخمیر كربوهیدرات، با تغییر رنگ قابل مشاهده معرف pH  یعنی فنل رد (از قرمز به زرد) نشان داده می شود. تولید سولفید هیدروژن با ایجاد رسوبی كه محیط را در عمق لوله سیاه می كند و نتیجه افزودن سولفات فروس به محیط است، نشان داده می شود.

برای تسهیل در جداسازی ارگانیسم هایی كه فقط دكستروز را تخمیر می كنند، غلظت دكستروز یك دهم
(1/0) غلظت لاكتوز یا ساكاروز است. مقدار كم اسید تولید شده در سطح شیب دار لوله در طی تخمیر دكستروز، به سرعت اكسید می شود و باعث می شود محیط به
pH  قلیایی( قرمز  ) برگردد. در مقابل،  بدلیل فشار پایین تر اكسیژن در عمق، واكنش اسیدی (زرد) حفظ می شود.

توجه: به هنگام تهیه محیط كشت باید دقت نمود كه طول سطح شیب دار و عمق محیط كشت در لوله، حدوداً 3 سانتی متر باشد.

 

3- نمونه اولیه :

- كشت ارگانیسم بر روی یك پلیت محیط مورد استفاده برای کشت انتروباکتریاسه

 

4-  مواد و تجهیزات مورد نیاز:

- لوله محیط كشت TSI  بصورت شیب دار

 

5-  روش انجام كار:

با استفاده از آنس سوزنی استریل خنك، رشد را از مركز یك كلونی كه به تازگی روی پلیت محیط مورد استفاده برای كشت انتروباكتریاسه رشد كرده است، به سطح شیب دار TSI Agar انتقال دهید و آن را با حركت آنس در امتداد سطح شیب دار، كشت دهید و سپس عمق را با سوراخ كردن محیط، تلقیح نمایید. لوله ها را با در پوش های شل شده به مدت 24-18 ساعت در دمای C ° 2± 35  در اتمسفر هوازی انكوبه نمایید.

  واكنش های تولید شده توسط ایزوله مجهول را با ارگانیسم های كنترل، مقایسه نمایید. تخمیر كربوهیدرات با رنگ زرد محیط نشان داده می شود.

اگر محیط در عمق لوله زرد شود (اسیدی) اما در سطح شیب دار قرمز شود (قلیایی)، ارگانیسم تحت بررسی فقط دكستروز (گلوكز) را تخمیر می كند.

 رنگ زرد (اسیدی) در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد كه ارگانیسم تحت بررسی، دكستروز، لاكتوز و یا ساكاروز را تخمیر می كند.

 رنگ قرمز (قلیایی) در سطح شیب دار و عمق، نشان می دهد كه ارگانیسم تحت بررسی، یك غیر تخمیر كننده (Nonfermenter) است.

تولید سولفید هیدروژن سبب تولید رسوب سیاه در عمق لوله می شود.

تولید گاز با شكاف و ترك خوردگی محیط نشان داده می شود.

 

6-  برنامه كنترل كیفی (QC):

 

H2S

گاز

عمق

سطح شیبدار

ارگانیسم

-

+

A

A

 Escherichia coli ATCC 25922

-

-

K

K

 Pseudomons aeruginosa ATCC 27853

+

+

A

K

 Salmonella typhimurium ATCC 14028

-

-

A

K

 Shigella flexneri ATCC 12022

 

A: اسیدی (زرد)    K: قلیایی ( قرمز )   

 

7-  تداخلات: 

-        برای حفظ شرایط قلیایی سطح شیب دار باید با بستن درپیچ لوله بصورت شل، اجازه داد كه تبادل آزاد هوا صورت گیرد. اگر لوله محكم بسته شود، واكنش اسیدی (ایجاد شده فقط با تخمیر دكستروز) سطح شیب دار را درگیر خواهد كرد.

-       بعضی از ارگانیسم ها ممكن است تولید سولفید هیدروژن را روی KIA  نشان دهند، اما روی TSI  نشان ندهند، چون استفاده از ساكاروز در TSI Agar، مكانیسم آنزیمی را كه در تولید H2S اثر
 می گذارد مهار می كند. بویژه سالمونلای تولید كننده
S H2 و بعضی از اعضاء انتروباكتریاسه نمی توانند روی  TSI Agar،S  H2 تولید کنند.

-        سولفات فروس موجود در این محیط( به عنوان معرفS H2 ) گاهی دارای حساسیت كمتری نسبت به سایر نمك های فریك می باشد. بنابراین ممكن است در ایجادS H2  در TSI و KIA  با سایر محیط های كشت مثل SIM  مغایرت هایی دیده شود.

-                    چون عمق لوله های  KIA و TSI، با تخمیر گلوكز  اسیدی می شود ، سیاه شدن اغلب در ته لوله وجود دارد یا به همان جا محدود می شود ( بویژه با باكتریهای غیر تخمیر كننده لاكتوز) بنابراین اگر عمق سیاه است باید آن را اسیدی در نظر گرفت.