1-  هدف :  

تشخیص و تمایز اعضای خانواده آنتروباكتریاسه براساس میزان فرآورده نهائی ناشی از متابولیسم گلوكز و تولید اسید از طریق مسیر Mixed  Acid  Fermentation  

 

2-  اساس آزمایش :

معرف متیل رد یك اندیكاتور pH است كه در محدوده بین pH 6 (زرد ) و pH 4.4 (قرمز ) واکنش نشان می دهد. اسیدیته ای كه در آن معرف متیل رد قادر است تا تغییر رنگ ایجاد نماید بسیار كمتر از سایر معرفهای بیولوژیكی بوده و تنها در مجاورت اسیدیته بالا، در مسیر تخمیر چند اسید از گلوكز می تواند ایجاد واكنش نماید.

برخی از انتروباكتریاسه ها فقط در ابتدای دوره انكوباسیون تولید اسید مینمایند ولی تنها باكتری هایی كه قادر باشند برای مدت طولانی طی انكوباسیون 72-48 ساعت pH محیط را در حد پایین حفظ نمایند دارای واكنش مثبت میباشند.

 

3- نمونه اولیه :

كشت  خالص و تازه از باكتری مورد نظر ( كشت 24 -18 ساعته )

 

4-  مواد و معرفها :

-       MR/VP Broth  با pH نهایی  9/6

-       معرف متیل رد كه عبارت است از 0.1 g  پودر متیل رد در 300ml  الكل اتیلیك 95%  و 200ml  آب مقطر

توجه : ابتدا پودر متیل رد را باید در الكل حل نمود و سپس آب به آن اضافه كرد. محلول تهیه شده را باید در شیشه تیره و در یخچال نگهداری نمود. جهت مصرف روزانه و هفتگی آنرا در لوله های در پیچدار به حجم 5/2میلی لیتر ریخته و در یخچال بگذارید.

 

 4-  روش انجام آزمایش : 

-       ابتدا چند كلنی از كشت خالص باكتری را در لوله حاوی 5/2 میلی لیتر MR/VP Broth   تلقیح نمایید.

 48 - 72ساعت ( حداكثر 5 روز)  در 350C  انكوبه نمائید.

- سپس  5 قطره از معرف متیل رد را به Broth اضافه نمایید و نتیجه واكنش را براساس تغییر رنگ حاصله بررسی كنید.

  ایجاد رنگ زرد               واكنش منفی

 ایجاد رنگ قرمز               واكنش مثبت در نتیجه تولید اسید زیاد و ایجاد pH<4.5  است.

 ایجاد رنگ نارنجی            واكنش منفی   

 

جهت كوتاه تر كردن زمان نتیجه گیری می توان حدود 5/0 میلی لیتر MR/VP Broth   را در لوله ای ریخته و مقدار نسبتاً زیادی از میكروب را در آن تلقیح نمود و پس از انكوباسیون 24-18 ساعته در 350C ،  2-1  قطره معرف متیل رد  را به آن اضافه کرده، واكنش را مشاهده نمود.

 

5-  برنامه  كنترل كیفی:

 كنترل مثبت:  25922     Ecoli  ATCC

كنترل منفی:  انتروباكتر آئروژینوزا 13048،  Klebsiella Pneumoniae  ATCC  13883

 

توجه :  در هر روز كاری، قبل از انجام آزمایش، كنترل كیفی باید با سویه های مثبت و منفی انجام شود.