1-  هدف:

جداسازی انتخابی ویبریوهای كلرا و ویبریو پاراهمولیتیكوس

 

2-  اساس آزمایش:

TCBS  آگار  Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar محیطی انتخابی برای جداسازی ویبریوكلرا و ویبریوپاراهمولیتیكوس و نیز دیگر ویبریوها است.

-       مهار باكتری های گرم مثبت با افزودن Oxgall (صفرای گاوی، محتوی مخلوطی از نمك های صفراوی و Sodium Cholate  ) انجام می شود.

-       تیوسولفات سدیم به عنوان منبع سولفور عمل می كند و در تركیب با سیترات فریك، تولید سولفید هیدروژن می كند.

-       ساكاروز بعنوان كربوهیدرات قابل تخمیر برای متابولیسم ویبریوها موجود است.

-        pH قلیائی محیط، جداسازی ویبریوكلرا را افزایش می دهد. تیمول بلو و برم تیمول بلو به عنوان معرف های تغییر pH  موجودند.

 

3- نمونه اولیه :

-       سواب های محتوی ماده نمونه در محیط كشت انتقالی كری ـ بلر (& Blair Cary) 

 

4- مواد و ابزار لازم :

-       آب پپتونه قلیایی

-       محیط كشتTCBS  

 

5-  روش انجام كار:

حتی الامكان به محض دریافت نمونه، آن را كشت دهید. نمونه هایی مثل سوابهای مقعد، مدفوع، ماده استفراغ شده، ماهی یا غذاهای دیگر را می توان با سواب به طور مستقیم روی محیط تهیه شده در پلیت برد. تلقیح زیاد، مخصوصاً اگر نمونه ها تازه نیستند، توصیه می شود. اگر تأخیری در رسیدن نمونه به آزمایشگاه پیش بینی می شود، سواب های محتوی ماده نمونه را باید در محیط انتقالی كری ـ بلر به آزمایشگاه منتقل نمود.

برای جداسازی ویبریوكلرا و دیگر گونه های ویبریو از مدفوع، آب پیتونه قلیایی وTCBS   به كار می رود. یعنی نمونه را ابتدا داخل آب پپتونه قلیایی حاوی 1% NaCl (5/8 = pH) برده و به مدت 8-5 ساعت در دمای       C ° 35 انكوبه نمایید و سپس روی محیط TCBS کشت دهید.

 اما در مواقع اورژانس و کمبود وقت توصیه می شود قبل از قرار دادن سواب در آب پپتونه قلیایی, سواب را بر روی یک پلیت TCBS بکشید, پلیت را کشت داده و انکوبه نمایید و سپس سواب را در آب پپتونه قلیایی برده و به مدت 8-5 ساعت در دمای C ° 35 انكوبه نمایید و پس از آن ساب کالچر مجددی بر روی پلیت TCBS تهیه نمایید.

پلیت ها را دور از نور نگهداشته و به مدت 24-18 ساعت در دمای C °2± 35 انكوبه نمایید. اگر بعد از 24 ساعت منفی بود برای 24 ساعت دیگر انكوبه نمایید.

-       توجه : از زمان تهیه محیط  TCBS  نباید بیش از یک هفته گذشته باشد. همچنین محیطهای TCBS باید در کیسه های فریزر در بسته در یخچال نگهداری شوند.

 

نکته: برای كشت ویبریوها نباید نمونه ها را فریز كرد.

 

6-  برنامه كنترل كیفی (QC): 

Vibrio Cholerae ATCC 9459:  رشد متوسط تا زیاد، كلونی های زرد

Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802:  رشد متوسط تا زیاد، كلونی های آبی

Escherichia coli ATCC 25922: اگر رشد كند،كلونی ها كوچك و شفاف هستند.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145: رشد به طور جزئی یا كامل مهار می شود. اگر رشد كند، كلونی ها آبی هستند.

Streptococcus faecalis ATCC 29212: رشد به طور جزئی یا كامل مهار می شود. اگر رشد كند، كلونی ها كوچك و زرد هستند.