-  هدف:

-       جداسازی انتروباكتریاسه ها ( كه همه اكسیداز منفی هستند ) از باكتری هایی مثل ویبریوناسه، آئروموناس، سودوموناس، نیسریا، كمپیلوباكتر و پاستورلا( كه همه اكسیداز مثبت اند)

-         شناسایی ارگانیسم هایی كه فاقد آنزیم سیتوكروم اكسیدازند یا بی هوازی اجباری می باشند.

2-  اساس آزمایش:

سیتوكروم ها، هوموپروتئین های حاوی آهن می باشند كه در زنجیره تنفسی عامل انتقال الكترون (هیدروژن ) به اكسیژن هستند. در این تست از یك معرف رنگی استفاده می شود كه بجای اكسیژن به عنوان پذیرنده نهائی الكترون جایگزین می گردد.

 

3- نمونه اولیه :

-       كشت 24-18 ساعته از ارگانیسم مورد نظر از محیط های كشت مناسب

 

 

4- مواد و ابزار لازم :

-   محلول 1% تترامتیل پارافنیلن دی آمین دی هیدروكلراید در آب مقطر استریل یادیسك تجاری آماده اكسیداز

-    كاغذ صافی

-   اپلیكاتور چوبی یا لوپ پلاستیكی یا پلاتینیوم

 

5-  مراحل انجام كار:

الف ـ روش مستقیم روی پلیت:

دو تا سه قطره از معرف تازه تهیه شده را مستقیماً روی كلنی های باكتری بر روی پلیت اضافه می كنیم.  كلنی های باكتری های اكسیداز مثبت بلافاصله به رنگ بنفش تغییر رنگ می دهند.

 

ب  ـ روش غیر مستقیم:

-       از پودر معرف ، محلول 1% در آب مقطر تهیه كنید وml 10 از محلول را در مقادیرml 1 تقسیم كرده در برودت 20- درجه در  فریزر نگهداری نمایید. موقع مصرف یك ویال از فریزر خارج كرده ، پس از ذوب شدن ، به تعداد مورد نیاز كاغذ صافی را به معرف آغشته كرده در پلیت تمیز قرار دهید. البته می توان ازدیسك های آماده تجاری نیز استفاده نمود .

-       مقداری از كلنی باكتری را روی كاغذ حاوی معرف می كشیم. (توصیه می شود كه از مشتق تترامتیل پارافنیلن دی آمین بجای مشتقات دی متیل استفاده شود، زیرا این معرف برای ذخیره كردن پایدارتر و برای تعیین سیتوكروم اكسیداز حساس تر است و نسبت به مشتق دی متیل، كمتر سمی می باشد.)

 

 

-       در باكتری های اكسیداز مثبت در محل تلقیح كلنی در عرض 10 ثانیه رنگ آبی تیره ( مایل به بنفش) ایجاد می شود (زمان بسیار مهم است). اما باكتری های اكسیداز منفی در عرض 10 ثانیه بیرنگ باقی می مانند. باكتری هایی كه در مدت 60 –10 ثانیه رنگ بنفش ایجاد می كنند، نیاز به انجام تست های بیشتری دارند، زیرا احتمالاً متعلق به خانواده آنتروباكتریاسه نمی باشند.

 

6-  برنامه  QC:

كنترل كیفی باید برای هر سری جدید و هر زمان که این تست انجام می شود، صورت گیرد.

كنترل مثبت: Pseudomonas aeruginosa    

كنترل منفی:   E.Coli

 

7-تداخلات:

-                    نباید از كشت كهنه ( بیشتر از 24 ساعت) استفاده شود.

-                   محلول 1%  اكسیداز باید بصورت تازه و روزانه تهیه شود مگر اینكه محلول ساخته شده در فریزر نگهداری گردد.

-                   نباید از محیط های كشت رنگی مثل مك كانكی استفاده شود زیرا نتیجه مثبت كاذب می دهد.

-                   برای انتقال باكتری روی كاغذ صافی یا دیسك اكسیداز نباید از لوپ فلزی مثل استیل یا نیكروم استفاده شود، زیرا بر اثر سوزاندن لوپ، مقدار كمی اكسید آهن بر روی آن ایجاد می شود، كه ممكن است نتیجه مثبت كاذب دهد.

 

8- ایمنی

بدلیل ایجاد تحریك ، از تماس معرف با پوست و چشم خودداری نمایید . در صورت تماس اتفاقی پوست یا چشم را با مقادیر زیادی آب  حداقل به مدت 15 دقیقه شستشو دهید .